分光光度法测定叶绿素含量的原则

原则叶绿素广泛存在于水果、蔬菜等绿色植物组织中，在植物细胞中与蛋白质结合形成叶绿体。植物细胞死亡时，叶绿素是游离的，游离的叶绿素很不稳定，对光热敏感；在酸性条件下，叶绿素产生绿褐色的脱镁叶绿素，脱镁叶绿素在稀酸碱液中水解成亮绿色的叶绿素以及叶绿醇和甲醇。高等植物中的叶绿素有两种：叶绿素a和b，均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素含量的测定方法很多，主要有：
1、原子吸收光谱法：通过测定镁的含量，进而间接计算出叶绿素的含量。
2、分光光度法：用分光光度计测定叶绿素提取物在最大吸收波长处的吸光度值，利用朗伯-比尔定律计算提取物中各色素的含量。
叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有最大吸收，两条吸收曲线在652nm处相交。因此，测定提取物在645nm、663nm、652nm波长处的吸光度，根据经验公式分别计算出叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量。
材料和仪器
植物材料96%乙醇丙酮石英砂碳酸钙粉分光光度计电子顶载天平砂浆棕色容量瓶定量滤纸吸水纸擦拭纸滴管漏斗
步骤
1、取新鲜植物叶子（或其他绿色组织）或干燥材料，擦去组织表面的污垢，去除中脉，切块。称取刚切碎的样品2g，放入研钵中，加入少量石英砂、碳酸钙粉和3mL95%乙醇，研磨成均质浆液，加入10mL乙醇，继续研磨直到组织变白。静置 3-5 分钟。
2、取一张滤纸置于漏斗中，用乙醇润湿，将提取物沿玻璃棒倒入漏斗中，滤液流入100mL棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵和研杵及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
3、用滴管吸乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直到滤纸上没有绿色和残留物为止。最后，用乙醇稀释至100mL，摇匀。
4、取叶绿体色素提取物分别在665nm、645nm和652nm波长处测定吸光度，以95%乙醇为空白对照。
防范措施
1、光照对叶绿素有破坏作用。实验应在弱光下进行，研磨时间尽量短。
2、如果色素提取液中混有其他物质引起混浊，会影响吸光度的测定，应重新过滤或离心。
3、测量色素的吸光度前，应根据仪器说明书和标准叶绿素a、b校准分光光度计的波长，否则会影响叶绿素含量的测量精度。
常见问题
1、无水乙醇提取时间较长，对某些物质尤其是木本植物的叶绿素提取不够完全。无水丙酮萃取会出现浑浊，影响比色测定。因此，提取叶绿素最好选择丙酮和无水乙醇，比例为2：1效果更佳。
2、传统的80%丙酮法由于含水量高，提取速度慢，测定值低，叶绿素稳定性差，应慎用。原则叶绿素广泛存在于水果、蔬菜等绿色植物组织中，在植物细胞中与蛋白质结合形成叶绿体。植物细胞死亡时，叶绿素是游离的，游离的叶绿素很不稳定，对光热敏感；在酸性条件下，叶绿素产生绿褐色的脱镁叶绿素，脱镁叶绿素在稀酸碱液中水解成亮绿色的叶绿素以及叶绿醇和甲醇。高等植物中的叶绿素有两种：叶绿素a和b，均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。